在把凯撒的财源和军队瓦解以及把达芬奇制造的的战争机器毁灭后,艾齐奥于1503年潜进梵蒂冈圣天使城堡。在欲与教皇对质时得知“伊甸碎片”已落入教皇手上,而教皇因不满其子无穷的野心(包括对蒙特里久尼发动攻击)而对凯撒下毒。凯撒得知后反用毒苹果杀死教皇,并到圣彼得大教堂夺回伊甸园碎片金苹果,但被艾齐奥先行夺得。同年12月,教皇儒略二世即位并下令拘捕凯撒。1507年3月艾齐奥前往西班牙维安纳并于围城战中与凯撒进行最后决斗,艾齐奥把凯撒击败后将其从城墙投下,最后把金苹果藏在罗马斗兽场的一个密室内。 戴斯蒙德等四人在找出密室密码后前往正进行工程的斗兽场,并从地下通道进入天坛圣母堂。在启动教堂内机关后,戴斯蒙德四人成功进入位于教堂地底之朱诺神殿(就是伊甸碎片所在地),但在戴斯蒙德拿起伊甸碎片时,被称为朱诺的立体影像(属远古时期“第一文明”种族)控制了其身体使其对露西腹部刺了一刀,至此游戏主线剧情结束。