2004年(《生化危机2》6年後),雨伞公司制作的T病毒因泄漏导致生化灾害,连串的负面新闻导致公司股票价格暴跌。美国联邦政府在各国政府的压力下暂停雨伞公司的业务,其後公司便宣告破产,所有地下研究中断,T病毒的传播得以停止。 当年被卷进浣熊市生物灾害的前警员里昂·史考特·肯尼迪(Leon S. Kennedy)已成为美国总统直辖的最高机密组织成员。某日奉命到西班牙某村庄营救总统被拐去的女儿雅士利·格拉汉(Ashley Graham)。到达该处後里昂发现所有村民均与他敌对,且在对抗时发现他们效忠於一个名为「光明教团」(Los Illuminados)的邪教团体。因此里昂最严苛的冒险就此展开。